– Entrevista a un experto local en PCR para conocer cómo se aplica en Uruguay ese test, y cuáles son las dificultades y problemas en detalle 

Una investigación en profundidad de eXtramuros revela detalles íntimos sobre el manejo de las pruebas PCR en Uruguay. A partir de fuentes directas que incluyen algunos de los técnicos que trabajan en las empresas que proveen el servicio de tests en Uruguay, queda al descubierto la generalizada vulnerabilidad y falta de control de los procedimientos en los que se basan los números oficiales de la pandemia -tanto en relación a los «casos» como a los «muertos por COVID-19». Esas mismas fuentes también nos alertan y nos ayudan a perfeccionar nuestras propias críticas al test, haciéndolas más específicas y afinadas, en la medida en que obtenemos más y más información de calidad sobre la «cocina» de los tests en el país.
Un trabajo del GACH insiste en que no se debe informar el número Ct al que se obtuvieron los resultados. Lo transcribimos y comentamos a continuación de esta entrevista. 
Le presentamos además a las empresas principales que brindan el servicio de tests PCR en Uruguay, los kits que usan, y los detalles técnicos de los mismos -entre ellos, qué umbral de ciclos Ct tienen fijado, y qué tipo de controles internos implementan, en el caso de que conste así a nuestras fuentes. 
Son estos tests PCR los que le están diciendo a la población del Uruguay casi todo lo que esta cree saber sobre la marcha de la «pandemia» en el país.


Por Aldo Mazzucchelli

Lo que sigue es una entrevista a un profesional universitario, Doctor en Ciencias Biológicas, que ha trabajado en su laboratorio con la técnica PCR desde hace décadas. A partir de datos públicos y entrevistas realizadas en confianza a técnicos que están realizando los tests en algunas instituciones y hospitales en el país, describe -apoyándose en su conocimiento técnico y su experiencia práctica en el tema- algunos detalles relevantes del problema al que se enfrenta nuestra ciudadanía. Lo que hay detrás de esos números de «casos» y de «fallecidos» que, al final del día, son lo único que se brinda como «verdad dura» respecto de la marcha de la llamada pandemia. La identidad de nuestro entrevistado queda protegida bajo el concepto de secreto profesional periodístico.

– En nuestra conversación previa nos explicabas que, a partir de tus investigaciones surgían una serie de elementos nuevos que conviene agregar al conocimiento del público. ¿Podrías detallarlos?

– Hay varios problemas con lo que se está haciendo en los laboratorios, así como con las críticas que se están haciendo a esas prácticas. El asunto no es blanco negro. 
Para empezar, este PCR no es cuantitativo, aunque su diseño apunta a eso, sino cualitativo, a fin de que dé simplemente un resultado positivo o negativo. Es una prueba binaria pues, y no debiera serlo, sino que la transformaron en binaria. Por eso es que fijaron un «Ct de corte». Esto que adolece de varios defectos metodológicos.

El primero es que no se hace (salvo alguna excepción) una curva de calibración al correr la muestra.
¿Cómo se hace esa curva? Se diluyen muestras decrecientes de ARN viral sintético, o de ADN retrocopiado (lo que se amplifica). Se hace con ello una curva de calibración en la cual las muestras más concentradas salen a un Ct más bajo, y las muestras más diluidas a un Ct más alto. Y eso sirve para fijar parámetros como el umbral del ensayo, la línea base, y sirve para saber si la señal que se está obteniendo es significativa o no. ¿Con respecto a qué? A la cantidad de moléculas que estás detectando. 

Ahora bien, ¿cuál es el problema? Que lo anterior no se hace. No se hace curva de calibración en cada ensayo.

La curva de calibración se hace al desarrollar y validar el método, donde se estudian ocho parámetros: la sensibilidad, que está muy relacionada a la linealidad / eficiencia de amplificación. Para que un ensayo sea exacto debe cumplir con la veracidad (medida del sesgo) y la precision (grado de dispersión entre las medidas). 

Segundo problema: Con el Ct que arroja la amplificación del ARN viral, se está obteniendo es un numerador, pero falta un denominador. Me explico, no se puede calcular la carga viral, lo que es relevante desde el punto de vista clínico.

Eso –tercer problema-, asumiendo que lo que se está levantando es una partícula viral, porque en realidad lo que se detecta son fragmentos de virus que pueden estar dentro de un virus activo, o no. La técnica no discrimina entre fragmentos de virus «vivos» o activos, y fragmentos de virus «muertos», o directamente trozos sueltos de material genético (por ejemplo, que hayan quedado de una infección anterior ya superada por el cuerpo mismo). 

Ahora bien, además está el control interno CIP, o control positivo. Este control se puede hacer de dos maneras. Una agregando simplemente un control positivo (en una cantidad conocida) en uno de los tubos que se va a amplificar. Y se amplifica, y se ve que dé señal por debajo de determinado Ct. Así es como se dan los informes. Y le llaman «control interno»; por debajo de 30, válido, dependiendo del kit utilizado. 

Cuarto problema: Ese control interno tendría que utilizarse, además, en los hisopados, lo que sería un control de extracción.

Me explico: es tan farragosa la técnica de pasar del hisopado al tubo de PCR -es un hisopado, lo tienen que poner en una solución, después esa solución la retrocopian a ADN, que es lo que se amplifica-.  Entonces tendrían que estar haciendo lo que se llama el «salpicado»- como a veces le llamamos, a partir de su denominación en inglés- de los hisopos, para hacer la extracción a partir de allí. Y ver que estás levantando tu control positivo. Eso a veces se hace, a veces no se hace. Hay gente que lo hace y gente que no lo hace.


Pero además está el control interno -que te decía se puede poner en un tubo de PCR o se puede poner en el hisopado, o incluso se puede poner en una muestra de persona totalmente sana, que tenga test negativo, para ver si hay interferencia en la PCR. Porque los restos celulares tienen compuestos potencialmente inhibidores de la PCR, y entonces si el hisopado viene con sangre (grupos hemo de la hemoglonia), es más difícil que te dé un resultado positivo. Esos serían falsos negativos. Y nosotros tenemos que tener cuidado que no haya interferencia. Y eso, quinto problema, tampoco sabemos si se está haciendo.  

Lo que se está haciendo es me parece, pues, una PCR bastante a las apuradas, que podría y debería optimizarse más.

Porque más allá de esos controles internos… Y acá voy a una cosa importante que mencioné antes al pasar: hay un denominador que está faltando para poder calcular carga viral (sobre todo en un Ct alto)... Y aún con uno bajo, uno puede asumir: «le dio un Ct de 12… le dio un Ct de 20… y tiene síntomas…«, entonces «bueno, esta persona tiene una carga viral alta«… Pero lo que falta ahí es conocer la cantidad de células que estás amplificando. Me refiero a que hay hisopados que levantan un montón de material, y otros  hisopados que no levantan casi nada. 

– ¿Y eso es imposible de medir?

– No, no es imposible de medir. Hay algunos kits que traen lo que se llama el control endógeno, y el control endógeno levanta un fragmento de un gen humano. Por ejemplo la Ribonucleasa P, o Rnasa P. Ésta, transcrita de una manera que le llaman constitutiva, constante, más o menos tendría que ser algo similar en todas las personas. Esta misma es una asunción bastante temeraria, pero bueno, es un control de ARN interno, endógeno, que se ha validado para otros ensayos. Ese control endógeno no todos los kits lo traen. Pero si lo hacen, no lo hacen cuantitativo, también es binario, debe dar por debajo de cierto valor Ct para validar el ensayo. Con lo cual, al no ser cuantitativo, vos no podés estar relacionando un número de Ct que te sale con uno de los fragmentos de los genes virales, con otro número significativo. Lo que se obtiene es un numerador al que le falta el denominador. Sexto problema, entonces.


Así pues, desde el punto de vista epidemiológico, coincido con colegas europeos en que está faltando ese dato, que sería fundamental para decir «uh, mirá, esta persona tiene una carga viral alta«. Porque no es lo mismo un positivo con una carga viral enorme, a uno con una carga viral ínfima. 

– Entonces, ¿los resultados que se obtienen son inseguros?

– Algunos laboratorios aseguran estar haciendo todos los controles habidos y por haber, incluso más de los que los piden. Pero me consta que hay dos grupos de tests y laboratorios en Uruguay. Unos hacen las cosas mejor dentro de las limitaciones del ensayo (kit), y otros hacen las cosas para ganar dinero.
Todo el tema que se ha armado con Drosten es muy cierto, pero ya nadie usa su método, pero por culpa de Drosten la OMS sacó la estrategia Tetris.

– Claro, Christian Drosten fue el legitimador de usar el PCR como patrón oro de todo esto. Es un problema político, no técnico. Hemos publicado los detalles de los problemas que tenía el estudio de Drosten en números pasados.

– Exacto, es un problema político y no técnico, porque ya nadie usa las cosas de Drosten, aunque sigue siendo citado incluso en algunos prospectos de los kits.

– De acuerdo. Pero igual, en la medida en que parece ser -por lo que nos explicas- un caos este mundo interno de los PCR, y que mucha gente o alguna gente los está usando para hacer dinero, eso hace que los resultados generales, los números que tenemos, sean problemáticos. Es decir, no podemos comparar los números de una medición el jueves en Rivera con los del lunes en Montevideo, porque uno no sabe cuál es la participación de cada empresa en esos números, ni como corrieron los tests, ni cuáles fueron los Ct empleados, ni los controles aplicados… Es decir…

– Exactamente. Y eso es lo que se debería hacer transparente. Y ser capaces de distinguir entre diferentes kits, modos de aplicación, responsabilidad de los distintos proveedores, números Ct… Además se deben cambiar los cebadores de acuerdo a las mutaciones que va teniendo este virus, como tienen todos los demás. Algunos kits lo hacen, otros no. Algunos laboratorios están intentando hacerlo mejor, dentro de las limitaciones que se conocen. Porque todo el mundo sabe que esto no sirve para diagnóstico así como está.

– Bueno, pero esa es la clave de todo. Todo lo otro es muy secundario en relación a esta afirmación que hacés. La clave es que no sirve para diagnóstico

– Este ensayo solo, así como está, no. 

 – ¿Significa que puede ayudar dentro de un conjunto clínico, con signos y demás…?

– Eso es. Hay hospitales que operan así. El resultado de la PCR pasa a un formulario donde hay varias otras cosas (incluido el Ct), y es parte del seguimiento del paciente. Incluso se repite la PCR cada pocos días para ver en qué parte de la curva de la infección está, si está aumentando o no la carga viral. Siempre con esa duda que queda de si la carga viral que están detectando, el Ct que les dio, es realmente un Ct válido o no, porque no están comparando contra un número de células de referencia. 

– Bueno, pero allí si hay una evolución clínica puede servir más la prueba, en la medida en que se la va comparando con una realidad externa que es el estado del paciente. 

– Ahora bien, cuando uno pregunta, ante esta realidad, por qué no se hace esto de manera más concienzuda, lo que obtuve como respuesta fue: «hay un tema de tiempos, y hay un tema de que encarecería el test«. A lo que yo respondí «pero el test sale 10 dólares de costo, y lo están cobrando a 100. ¡Que les cueste a ustedes 20 dólares! Igual vas a hacer una montaña de plata.» 

– ¿El Ministerio controla en la práctica esto? Me refiero a si, después que concedió una habilitación, eso es todo… o si sigue controlando en detalle cómo se aplica cada test, con qué controles, a qué umbral de ciclos…

– No lo sé, pero no lo creo. 

La pregunta es quién controla a cada una de las empresas que están operando. 

– No lo sé. El GACH seguro no es. Puede que haya alguna división del Ministerio que lo haga…

– Nosotros cuando le pedimos al Ministerio información concreta, nos lo contestaron luego de un tiempo, hace pocas semanas, y la bibliografía que ofrecían seguía siendo Drosten. Es literal lo que digo. 

– Si. Por eso digo… y es increíble porque Drosten ya no lo usa nadie y su trabajo ha sido demolido. Mal diseñado, resultados confusos, sin protocolo de uso, sin Cts! A lo que hay que sumar el evidente conflicto de intereses.. 

– Claro. Lo que sí pasó es que fue por esa movida de Drosten + Democracia Cristiana alemana (Merkel) + OMS + Gates (hay una reunión de coordinación de todos ellos en mayo de 2019 en la que representantes de todos esos actores hacen uso de la palabra), que la OMS declaró «pandemia». En este número publicamos una entrevista con detalles sobre esto. A partir de la movida Drosten + OMS, impusieron al mundo el mecanismo de usar el PCR al barrer y con independencia de la clínica. Algo que jamás se había hecho antes. Todos los médicos sabían que el PCR aislado tenía una confiabilidad relativa, incluso cuando se usaba en su mejor expresión. Este tipo de PCR estilo McDonalds drive through que se impuso en el mundo no serviría para diagnosticar. Sin embargo, es para lo que se lo usa, y todos los números políticos de la pandemia salen de él.

– Exactamente. El Programa Tetris: Test, Trace, Isolate (testear, rastrear, aislar). 

– Esa fue la movida inicial que generó todo lo que vino después. Ahora bien, yendo a lo específico, tus fuentes que trabajan directamente en la aplicación de los tests insisten en que en cierto modo hablar de Ct no tiene sentido, en la medida en que es una gama, un rango, y habría que tener números independientes cuantitativos de referencia, que no se tienen (porque no se buscan). 

– Sí. Profundicemos en eso. En primer lugar, los métodos suelen traer más de un marcador del virus. Por «marcador» me refiero a un segmento de ARN. ¿Por qué es esto de los dos marcadores? Porque si tomás un marcador en una parte del virus, y tomás otro marcador en otra parte del virus, te debería dar valores similares, teniendo en cuenta la llamada «eficiencia de amplificación», que no es igual para cada par de cebadores, y eso también es importante (a Drosten un par de cebadores directamente no le funcionó, no pudo obtener nada en el paper original). Y la gente que trabaja en laboratorios determina eficiencia sobre el control positivo como un control interno del ensayo. Eso no aparece en el informe, pero tienen que testear que el par de cebadores esté funcionando bien. El kit de ATGen es atípico en eso, porque trae solo uno, si bien la publicación original describe dos.

– Eso de cómo administrar resultados a partir de dos o tres cebadores ¿es algo que viene en los prospectos de los kits, o es algo que decide cada laboratorio?

– Eso viene en el manual de instrucciones de cada kit desarrollado y que esté en el mercado. Cada ensayo es diferente. Por supuesto que un ensayo que traiga tres marcadores, para mí es más robusto que uno que traiga uno solo. Esa es mi opinión. Conociendo los tests que se están usando en el mercado uruguayo en detalle, se puede categorizar entre ensayos más confiables y ensayos menos confiables. ASSE tercerizaba todo a ATGen. Algo pasó, que ya no lo hace. Pero no es una medida tomada sobre la totalidad. Parte de lo que recibe ASSE está yendo a laboratorios privados. 

Entonces, cada kit y cada par de cebadores tiene su Ct de corte definido en el manual. Entonces, me confimaban mis fuentes, algunos métodos indican determinado Ct. Por ejemplo, ATGen dice «hasta 35». Entre 45 y 40 repetir el ensayo. Lo cual ya es alto. Pero hay otros que usan números de corte más bajos, otros más altos… Porque además hay una variabilidad, inherente a cualquier método, de modo que uno siempre pone un más/menos algo. Dispersión de datos. O sea, si uno tiene datos que están dispersos, y uno hizo los ensayos por triplicado, entonces no es Ct «33». Es Ct «33 +/- 1, o +/- 2, etc.  Por eso se habla de rango. Y después está el rango de Ct significativos según el kit de que se trate. O sea, hay kits que a 20 cortan, y hay otros que lo llevan hasta 40. Esto es lo que es preciso averiguar con precisión. Porque es cosa sabida entre usuarios de PCR -y esto lo he comentado con mis colegas de forma abierta-…
– «Che, nosotros que hacemos PCR, sabemos que si estamos haciendo una PCR en tiempo real, y te dio un Ct de 35, no le damos pelota». 
– «Y no. Es cierto, siempre y cuando los controles den bien, repetimos todo, » –me contestan. 

Entonces es sabido entre la gente que está en el asunto que con un Ct de 35 estás amplificando restos de restos de restos, trazas. Yo les decía a mis colegas «bueno, en todo caso fijan el Ct hacia abajo«. Sí, -me responden-. Es significativo 20… quizá 25… En fin. Pero depende del método y de lo qué se quiera cuantificar.

– Claro. En resumen, lo que yo entiendo es que todo esto está un poco librado a la capacidad técnica, profesionalidad, o buena voluntad de cada uno de los operadores autorizados por el Ministerio.

– Si. Yo te cuento que el año 2020 fue el mejor año para los egresados de algunas facultades de la UdelaR. Porque los bioquímicos, biólogos, químicos, que estaban recibidos y estaban en su casa sin conseguir laburo, de repente les llovieron ofertas de trabajo para hacer esto desde todos lados. Lo cual en sí es positivo. Algunos se tuvieron que ir al interior, otros se quedaron por acá. Conozco muchos colegas incluso haciendo horas extra. A lo que voy es a que hay mucha gente formada , capacitada, que sabe trabajar bien y que está ahora en esto. Y casi nunca se animan a hablar, por esta misma coyuntura. Yo les puedo hacer preguntas genéricas, del estilo «¿y, todo bien con los tests?», y ellos responderme «si, todo bien«. Pero nadie quiere abrir mucho la boca. 
Resumiendo. Yo no tengo mucho más para aportar más allá de lo que vos publicaste, que lo dijiste muy bien. Esto profundiza y mejora lo que vamos sabiendo. Te lo agradezco enormemente.

– Te agradezco inmensamente tu análisis, y tu valentía. Y estoy seguro de que los lectores te lo agradecen también.


(*) Preparado especialmente para eXtramuros por un científico con décadas de experiencia en PCRs, a partir de datos públicos e investigación propia. Estos no son todos los tests empleados ni todos los laboratorios autorizados, sino solamente una selección de ellos. La columna «Quiénes lo usan» puede contener imprecisiones debido a cambios o ajustes en contratos posteriores al momento de relevar la información. La columna «Ct Target (diana, blanco)» corresponde a las indicaciones de los materiales oficiales adjuntos a cada kit, salvo aclaración o ampliación.
(**) Técnicamente se trata de qPCRs multiplex (varios targets a la vez). Para el cuadro se toma como referencia de nomenclatura (CIP, IEC) al kit de PrimerDesign por ser el más usado.

Referencias

[1]

COVID_19_Specificity_Statement_issue_45

Path_COVID_19_CE_IVD_IFU_Issue_2

Path_COVID_19_CE_STED_IFU_Issue_500

[2] «An effective COVID-19 response in South America: the Uruguayan Conundrum» V.A. 

[3]

COVID19_Compatibility_600-2020_01_EN

[4]

Altona-RealStar-SARS-CoV-2-RT-PCR-Kit-1.0_WEB_CE_ES-S03_384

Altona RealStar SARS-CoV-2 RT-PCR Kit 1.0_WEB_CE_ES-S03_(384).pdf;

https://altona-diagnostics.com/en/products/reagents-140/reagents/realstar-real-time-pcr-reagents/realstar-sars-cov-2-rt-pcr-kit.html

[5]

https://www.biofiredx.com/products/the-filmarray-panels/filmarrayrp/


El GACH SE REAFIRMA: NO CONVIENE INFORMAR SOBRE LOS VALORES Ct

En un documento de comienzos de este mes de febrero (*), el GACH informa y concluye que sigue siendo mejor no reportar el valor Ct al que se han obtenido los «casos positivos» a partir de los tests PCR realizados en el país.

Los argumentos del GACH (ver su documento adjunto al final) deben comentarse de varias formas.

1 – La negativa a cuantificar

Primero, el documento reconoce que ninguno de los kits empleados para el test «realiza la cuantificación de genomas virales, sino que simplemente se expresa la positividad de acuerdo a un valor pre-determinado del Cycle Threshold o CT de la mencionada técnica. La mayoría de los kits indican que un test es positivo cuando el valor de CT es menor o igual a 35«. Esto coincide con lo que se afirma en nuestra entrevista principal. Pero lo que quizá no esté claro es la implicancia que esto tiene. No cuantificar no es una limitación inherente a la técnica PCR: es una decisión deliberada tomada a nivel global con motivo de esta pandemia. Al transformar una técnica con capacidad cuantitativa, en una meramente cualitativa, y además establecer un Ct de corte arbitrario (e inaceptablemente alto) bajo el cual simplemente se dice «es un caso positivo», lo que se hace es reducir drásticamente la capacidad de diagnóstico preciso de la herramienta. 

2 – Si bien ya a Ct 24 no se puede cultivar el virus, permitimos que se diga «positivo» a Ct 35

Pero además, como el documento mismo lo reconoce renglones más abajo, «se ha demostrado también que no es posible aislar el virus en cultivos celulares con Ct mayor o igual a 24«. Esto se afirma en este documento, apenas se ha reconocido, líneas antes, que el Ct de corte de la mayoría de los kits empleados en uruguay es de 35… Es decir, para un test que dé positivo entre 24 y 35, en Uruguay, se está afirmando públicamente que la persona tiene virus activos y es un «infectado» (incluso se dice «tiene Covid-19 asintomático»). Pero al mismo tiempo el propio GACH reconoce que entre 24 y 35 está demostrado que no es posible encontrar virus en las muestras.

Pese a todos los problemas que acarrea lo anterior para la fiabilidad de las pruebas PCR, el documento insiste en que no se debe adjuntar a los informes el valor de Ct. Los argumentos específicos para ello son:

1) «No hay curva de calibración para calcular cuantitativamente la carga viral«

2) «el valor de CT no está necesariamente relacionado al número de partículas virales infecciosas… «

3) «La infección causada por SARS-CoV-2 es dinámica a lo largo del tiempo «por lo que no es posible saber con certeza el significado clínico del valor del CT«

4) «Informar el valor de CT puede generar confusiones al personal de salud en cuanto a las pautas y protocolos a seguir de acuerdo al valor del mismo«.

Comentarios

Sobre 1), el establecimiento de la curva de calibración sería una posibilidad. No se implementa por los prestadores, en parte al menos, porque aumentaría el costo de realización de cada test, perdiendo los prestadores parte de las ganancias que están obteniendo. Ver nuestra entrevista para mayor claridad respecto a qué significa «curva de calibración» y cómo se podría implementar en los tests.

Sobre 2) El adverbio «necesariamente» es la clave aquí. Puede no haber una correlación precisa generalizada entre carga viral y estado clínico del paciente debido a factores como debilidad o fortaleza del paciente, edad, comorbilidades, etc. Pero los médicos que están siguiendo a un paciente se benefician de la información de Ct -y de hecho, en algunos contextos hospitalarios nos consta que la solicitan y la tienen en cuenta- puesto que pueden compararla con la evolución clínica para cada paciente en particular. Si bien no hay un estándar general de correlación, ésta puede existir y ser útil para cada paciente en especial. 

Sobre 3) Existen estudios que muestran correlaciones temporales entre valor Ct y estado clínico del paciente (una vez más, solo para Ct menor a 24).

Sobre 4) Este argumento se concentra en la necesidad de uniformizar la respuesta en el personal de la salud, determinando la condición de «infectado» o «caso» de un modo absoluto, acrítico, y promoviendo así la aplicación de protocolos que no tienen en cuenta la condición clínica real del paciente. Al limitar la información sobre el Ct se blinda la crítica al mecanismo de diagnóstico universal elegido, ocultando una vez más sus múltiples problemas de confiabilidad, y creando una situación de alarma no necesariamente justificada respecto de la situación efectiva de contagios y gravedad de la enfermedad Covid-19.


¿Cómo se están administrando los dineros públicos en relación a la pandemia?

En otro lugar de ese mismo documento, en relación a la necesidad de determinar posibles «nuevas cepas», el GACH pide que se otorgue «una fuente de financiación fluida, no sujeta a concurso de proyectos, para que los laboratorios del país puedan acceder a los fungibles necesarios para realizar estas determinaciones genómicas«.

¿Debe esto leerse como que el GACH aconseja al gobierno que se le transfiera dinero del contribuyente a los laboratorios, sin los controles legales establecidos? De ser así (habría que ver los detalles de cada caso) sería un ejemplo de cómo la «pandemia» ha funcionado como un mecanismo de transferencia de recursos de lo público a lo privado, bajo el pretexto de la «situación excepcional». 


(*)

GACH-1-2-2021-aspectos_biomedicos_basicos_febrero_2021