* Estudio en Suecia demuestra que la vacuna Pfizer (BNT162b2) sí “se transcribe en sentido inverso y entra el núcleo de células humanas” (la Ortodoxia Covid ha insistido en lo contrario desde hace meses)
* “Nuestros resultados indican una rápida absorción de BNT162b2 en la línea celular de hígado humano Huh7, lo que conduce a cambios en la expresión y distribución de LINE-1” [un elemento endógeno al ADN humano]
* “También demostramos que el ARNm de BNT162b2 se transcribe de forma inversa en el ADN intracelular en tan solo 6 horas tras la exposición a BNT162b2”

Por Markus Aldén 1, Francisko Olofsson Falla 1, Daowei Yang 1, Mohammad Barghouth 1, Cheng Luan 1, Magnus Rasmussen 2 y Yang De Marinis 1,*

1 Departmento de Ciencias Clínicas, Universidad de Lund, 20502 Malmö, Suecia
2 Medicina de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad de Lund, 22362 Lund, Suecia

Editor académico: Stephen Malnick

Curr. Issues Mol. Biol. 2022, 44(3), 1115-1126; https://doi.org/10.3390/cimb44030073

Received: 18 January 2022 / Revised: 19 February 2022 / Accepted: 23 February 2022 / Published: 25 February 2022 (Este artículo pertenece a Topic Clinical, Translational and Basic Research on Liver Diseases)

Resumen

Los estudios preclínicos de la vacuna de ARNm de COVID-19 BNT162b2, desarrollada por Pfizer y BioNTech, mostraron efectos hepáticos reversibles en animales que recibieron la inyección de BNT162b2. Además, un estudio reciente demostró que el ARN del SARS-CoV-2 puede transcribirse en sentido inverso e integrarse en el genoma de las células humanas. En este estudio, investigamos el efecto del BNT162b2 en la línea celular de hígado humano Huh7 in vitro. Se expusieron las células Huh7 al BNT162b2 y se realizó una PCR cuantitativa sobre el ARN extraído de las células. Se detectaron altos niveles de BNT162b2 en las células Huh7 y cambios en la expresión génica del elemento nuclear intercalado largo-1 (LINE-1), que es una transcriptasa inversa endógena. La inmunohistoquímica realizada con un anticuerpo que se une a la proteína de unión al ARN del marco de lectura abierto LINE-1 (ORFp1) en células Huh7 tratadas con BNT162b2 indicó un aumento de la distribución de LINE-1 en el núcleo. La PCR en el ADN genómico de las células Huh7 expuestas a BNT162b2 amplificó la secuencia de ADN exclusiva de BNT162b2. Nuestros resultados indican una rápida absorción de BNT162b2 en la línea celular de hígado humano Huh7, lo que conduce a cambios en la expresión y distribución de LINE-1. También demostramos que el ARNm de BNT162b2 se transcribe de forma inversa en el ADN intracelular en tan solo 6 horas tras la exposición a BNT162b2.

Palabras clave: Vacuna de ARNm COVID-19; BNT162b2; hígado; transcripción inversa; LINE-1; Huh7

1. Introducción

La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) causada por el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2) fue anunciada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como una pandemia mundial el 11 de marzo de 2020, y surgió como una crisis sanitaria devastadora. Hasta febrero de 2022, el COVID-19 ha provocado más de 430 millones de casos de infección notificados y 5,9 millones de muertes en todo el mundo [1]. Se necesitan urgentemente vacunas eficaces y seguras para reducir las tasas de morbilidad y mortalidad asociadas al COVID-19.

Se han desarrollado varias vacunas para la COVID-19, con especial atención a las vacunas de ARNm (de Pfizer-BioNTech y Moderna), las vacunas de vectores adenovirales recombinantes de replicación defectuosa (de Janssen-Johnson and Johnson, Astra-Zeneca, Sputnik-V y CanSino) y las vacunas inactivadas (de Sinopharm, Bharat Biotech y Sinovac). La vacuna de ARNm tiene las ventajas de ser flexible y eficiente en el diseño y la fabricación de inmunógenos, y actualmente, numerosos candidatos a vacunas se encuentran en diversas etapas de desarrollo y aplicación. En concreto, la vacuna de ARNm de COVID-19 BNT162b2, desarrollada por Pfizer y BioNTech, ha sido evaluada en ensayos clínicos con éxito [2,3,4] y administrada en campañas nacionales de vacunación contra COVID-19 en diferentes regiones del mundo [5,6,7,8].

BNT162b2 es una vacuna de ARN modificada con nucleósidos (modRNA) y encapsulada en nanopartículas lipídicas (LNP), que codifica la longitud completa de la proteína de la espiga (S) del SARS-CoV-2, modificada por dos mutaciones de prolina para asegurar una conformación antigénica óptima antes de la fusión, que imita al virus intacto para provocar anticuerpos neutralizadores del virus [3]. En consonancia con los ensayos clínicos aleatorios, el BNT162b2 mostró una alta eficacia en una amplia gama de resultados relacionados con la COVID-19 en un entorno real [5]. No obstante, aún quedan muchos retos, como el seguimiento de la seguridad y la eficacia a largo plazo de la vacuna. Esto justifica una mayor evaluación e investigación. El perfil de seguridad de BNT162b2 sólo está disponible actualmente a partir de estudios clínicos a corto plazo. Se han notificado efectos adversos menos comunes del BNT162b2, como pericarditis, arritmia, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio, hemorragia intracraneal y trombocitopenia [4,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]. También hay estudios que informan de los efectos adversos observados en otros tipos de vacunas [21,22,23,24]. Para comprender mejor los mecanismos que subyacen a los efectos adversos relacionados con las vacunas, se necesitan investigaciones clínicas y análisis celulares y moleculares.

Un estudio reciente ha demostrado que los ARN del SARS-CoV-2 pueden transcribirse de forma inversa e integrarse en el genoma de las células humanas [25]. Esto da lugar a la pregunta de si esto también puede ocurrir con el BNT162b2, que codifica parcialmente el ARN del SARS-CoV-2. En los datos de farmacocinética proporcionados por Pfizer a la Agencia Europea del Medicamento (EMA), se estudió la biodistribución del BNT162b2 en ratones y ratas mediante una inyección intramuscular con LNP radiomarcada y modRNA de luciferasa. La radiactividad se detectó en la mayoría de los tejidos desde el primer punto de tiempo (0,25 h), y los resultados mostraron que el lugar de la inyección y el hígado eran los principales lugares de distribución, con concentraciones máximas observadas a las 8-48 h después de la dosis [26]. Además, en los animales que recibieron la inyección de BNT162b2, se observaron efectos hepáticos reversibles, como el agrandamiento del hígado, la vacuolización, el aumento de los niveles de gamma glutamil transferasa (γGT) y el aumento de los niveles de aspartato transaminasa (AST) y fosfatasa alcalina (ALP) [26]. Los efectos hepáticos transitorios inducidos por los sistemas de administración de PNL se han notificado anteriormente [27,28,29,30], sin embargo, también se ha demostrado que la PNL vacía sin modRNA sola no introduce ningún daño hepático significativo.[27] Por tanto, en este estudio, buscamos examinar el efecto de BNT162b2 en una línea celular de hígado in vitro e investigar si la BNT162b2 puede ser transcripta de modo inverso en el ADN a través de mecanismos endógenos.

Materiales y métodos

2.1. Cultivo celular
Las células Huh7 (JCRB Cell Bank, Osaka, Japón) se cultivaron a 37 °C a un 5% de CO2 con medio DMEM (HyClone, HYCLSH30243.01) complementado con un 10% (v/v) de suero fetal bovino (Sigma-Aldrich, F7524-500ML, Burlington, MA, EE.UU.) y un 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina (HyClone, SV30010, Logan, UT, EE.UU.). Para el tratamiento con BNT162b2, se sembraron células Huh7 con una densidad de 200.000 células/pocillo en placas de 24 pocillos. La vacuna de ARNm de BNT162b2 (Pfizer BioNTech, Nueva York, NY, EE.UU.) se diluyó con una inyección estéril de cloruro de sodio al 0,9%, USP, en una concentración final de 100 μg/mL, tal como se describe en la guía del fabricante [31]. A continuación, se añadió la suspensión de BNT162b2 en los medios de cultivo celular para alcanzar concentraciones finales de 0,5, 1,0 o 2,0 μg/mL. Las células Huh7 se incubaron con o sin BNT162b2 durante 6, 24 y 48 h. Las células se lavaron a fondo con PBS y se cosecharon por tripsinización y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.

2.2. RT-QPCR EN TIEMPO REAL

El ARN de las células se extrajo con el RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, 74134, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La RT-PCR se realizó con el kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific, K1622, Waltham, MA, USA) siguiendo el protocolo del fabricante. La qPCR en tiempo real se realizó utilizando la mezcla maestra Maxima SYBR Green/ROX qPCR (Thermo Fisher Scientific, K0222, Waltham, MA, EE.UU.) con cebadores para BNT162b2, LINE-1 y los genes de mantenimiento ACTB y GAPDH (Tabla 1).

Tabla 1: Secuencias de primer de RT-qPCR y PCR

2.3. Tinción de inmunofluorescencia e imagen confocal

Las células Huh7 se cultivaron en portaobjetos de ocho cámaras (LAB-TEK, 154534, Santa Cruz, CA, EE.UU.) con una densidad de 40.000 células/pocillo, con o sin BNT162b2 (0,5, 1 o 2 µg/mL) durante 6 h. La inmunohistoquímica se llevó a cabo utilizando un anticuerpo primario monoclonal de ratón anti-LINE-1 ORF1p (Merck, 3574308, Kenilworth, NJ, EE.UU.), un anticuerpo secundario Cy3 Donkey anti-mouse (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE.UU.) y Hoechst (Life technologies, 34850, Carlsbad, CA, EE.UU.), siguiendo el protocolo de Thermo Fisher (Waltham, MA, EE.UU.). Se tomaron dos imágenes por condición utilizando un Zeiss LSM 800 y un objetivo de inmersión en aceite de 63X, y se cuantificó la intensidad de la tinción en el área individual de la célula entera y en el área del núcleo en 15 células por imagen mediante ImageJ 1.53c. La intensidad de la tinción de LINE-1 para el citosol se calculó restando la intensidad del núcleo de la de toda la célula. A todas las imágenes de las células se les asignó un número aleatorio para evitar el sesgo. Para marcar los núcleos (determinados por la tinción Hoechst) y las células enteras (determinadas por los bordes de la fluorescencia LINE-1), se utilizó la herramienta de selección Freehand. A continuación se midieron estas áreas y se utilizó la intensidad media para comparar los grupos.

2.4. Purificación del ADN genómico, amplificación por PCR, purificación en gel de agarosa y secuenciación Sanger

El ADN genómico se extrajo de los pellets celulares con el tampón PBND (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween-20) según el protocolo descrito previamente [32]. Para eliminar el ARN residual de la preparación de ADN, se añadió RNasa (100 µg/mL, Qiagen, Hilden, Alemania) a la preparación de ADN y se incubó a 37 °C durante 3 h, seguido de 5 min a 95 °C. A continuación, se realizó la PCR utilizando cebadores dirigidos a BNT162b2 (las secuencias se muestran en la Tabla 1), con el siguiente programa: 5 min a 95 °C, 35 ciclos de 95 °C durante 30 s, 58 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min; finalmente, 72 °C durante 5 min y 12 °C durante 5 min. Los productos de la PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1,4% (p/v). Se recortaron las bandas correspondientes a los amplicones del tamaño esperado (444 bps) y se extrajo el ADN utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, 28104, Hilden, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuencia del amplicón de ADN se verificó mediante secuenciación Sanger (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania).

Estadísticas

Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba t de Student de dos colas y ANOVA. Los datos se expresan como media ± SEM o ± SD. Las diferencias con p < 0,05 se consideran significativas.

2.5. Declaraciones éticas

La línea celular Huh7 se obtuvo del Banco de Células de la Colección Japonesa de Recursos Biológicos de Investigación (JCRB).

3. Resultados

3.1. El BNT162b2 entra en las células de la línea celular de hígado humano Huh7 con gran eficacia

Para determinar si el BNT162b2 entra en las células hepáticas humanas, expusimos la línea celular hepática humana Huh7 al BNT162b2. En un estudio anterior sobre la cinética de captación de la entrega de la PNL en las células Huh7, la máxima eficacia biológica de la PNL se observó entre 4 y 7 h [33]. Por lo tanto, en nuestro estudio, las células Huh7 se cultivaron con o sin concentraciones crecientes de BNT162b2 (0,5, 1,0 y 2,0 µg/mL) durante 6, 24 y 48 h. Se extrajo el ARN de las células y se realizó una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) utilizando cebadores dirigidos a la secuencia de BNT162b2, como se ilustra en la Figura 1. La secuencia completa de BNT162b2 está disponible públicamente [34] y contiene una tapa de dos nucleótidos; la región no traducida (UTR) 5′ que incorpora la 5′ -UTR de un gen de α-globina humana; la longitud completa de la proteína S del SARS-CoV-2 con dos mutaciones de prolina; 3′-UTR que incorpora el segmento del 12S rRNA mitocondrial humano (mtRNR1) y el segmento del gen AES/TLE5 humano con dos mutaciones C→U; cola de poli(A). El análisis detallado de la secuencia de la proteína S en BNT162b2 reveló 124 secuencias que son 100% idénticas a las secuencias genómicas humanas y tres secuencias con sólo un desajuste de nucleótidos (nt) en 19-26 nts (Tabla S1, ver Materiales Suplementarios). Para detectar el nivel de ARN de BNT162b2, diseñamos cebadores con el cebador delantero situado en las regiones de la proteína S del SARS-CoV-2 y el cebador inverso en la 3′-UTR, lo que permite la detección del amplicón de la PCR exclusivo de BNT162b2 sin la unión inespecífica de los cebadores a las regiones genómicas humanas.

Figura 1. Conjunto de cebadores PCR utilizados para detectar el nivel de ARNm y la transcripción inversa de BNT162b2. La ilustración de BNT162b2 fue adaptada de la literatura previamente descrita [34].

Los resultados de la RT-qPCR mostraron que las células Huh7 tratadas con BNT162b2 tenían altos niveles de ARNm de BNT162b2 en relación con los genes de mantenimiento de la casa a las 6, 24 y 48 h (Figura 2, presentada en el registro 2-ΔΔCT debido a los niveles excepcionalmente altos). Las tres concentraciones de BNT162b2 condujeron a niveles similares de ARNm de BNT162b2 intracelular en los diferentes puntos temporales, excepto que la diferencia significativa entre 1,0 y 2,0 µg/mL se observó a las 48 h. Los niveles de ARNm de BNT162b2 disminuyeron significativamente a las 24 h en comparación con las 6 h, pero volvieron a aumentar a las 48 h.

Figura 2. Niveles de ARNm de BNT162b2 en células Huh7 tratadas con BNT162b2. Las células Huh7 fueron tratadas sin (Ctrl) o con 0,5 (V1), 1 (V2) y 2 µg/mL (V3) de BNT162b2 durante 6 (puntos verdes), 24 (puntos naranjas) y 48 h (puntos azules). Se purificó el ARN y se realizó la qPCR utilizando cebadores dirigidos a BNT162b2. Los niveles de ARN de BNT162b2 se presentan como valores 2-ΔΔCT registrados en relación con los genes de mantenimiento GAPDH y ACTB. Los resultados proceden de cinco experimentos independientes (n = 5). Las diferencias entre los respectivos grupos se analizaron mediante la prueba t de Student de dos colas. Los datos se expresan como media ± SEM. (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 frente al control respectivo en cada punto temporal, o como se indica).

3.2. Efecto del BNT162b2 sobre la transcriptasa inversa endógena humana elemento nuclear intercalado largo-1 (LINE-1)

Aquí examinamos el efecto del BNT162b2 sobre la expresión del gen LINE-1. Se realizó una RT-qPCR sobre el ARN purificado de células Huh7 tratadas con BNT162b2 (0, 0,5, 1,0 y 2,0 µg/mL) durante 6, 24 y 48 horas, utilizando cebadores dirigidos a LINE-1. Se observó un aumento significativo de la expresión de LINE-1 en comparación con el control a las 6 h con 2,0 µg/mL de BNT162b2, mientras que las concentraciones más bajas de BNT162b2 disminuyeron la expresión de LINE-1 en todos los puntos temporales (Figura 3).

Figura 3. Niveles de ARNm de LINE-1 en células Huh7 tratadas con BNT162b2. Las células Huh7 fueron tratadas sin (Ctrl) o con 0,5 (V1), 1 (V2) y 2 µg/mL (V3) de BNT162b2 durante 6 (puntos verdes), 24 (puntos rojos) y 48 h (puntos azules). Se purificó el ARN y se realizó la qPCR utilizando cebadores dirigidos a LINE-1. Los niveles de ARN de LINE-1 se presentan como valores 2-ΔΔCT en relación con los genes de mantenimiento GAPDH y ACTB. Los resultados proceden de cinco experimentos independientes (n = 5). Las diferencias entre los respectivos grupos se analizaron mediante la prueba t de Student de dos colas. Los datos se expresan como media ± SEM. (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 frente al control respectivo en cada punto temporal, o como se indica; † p < 0,05 frente a 6 h-Ctrl).

A continuación, estudiamos el efecto de BNT162b2 sobre el nivel de proteína LINE-1. El LINE-1 de longitud completa consta de una región no traducida (UTR) 5′, dos marcos de lectura abiertos (ORFs), ORF1 y ORF2, y un 3′UTR, de los cuales el ORF1 es una proteína de unión a ARN con actividad chaperona. Se ha demostrado que la actividad de retrotransposición de LINE-1 implica la translocación de ORF1 al núcleo [35]. Las células Huh7 tratadas con o sin BNT162b2 (0,5, 1,0 y 2,0 µg/mL) durante 6 h fueron fijadas y teñidas con anticuerpos de unión a LINE-1 ORF1p, y con la sonda Hoechst específica de ADN para la visualización del núcleo celular (Figura 4a). La cuantificación de la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia mostró que el BNT162b2 aumentó los niveles de proteína LINE-1 ORF1p tanto en el área de la célula entera como en el núcleo en todas las concentraciones probadas (Figura 4b-d).

Figura 4. Inmunohistoquímica de las células Huh7 tratadas con BNT162b2 sobre la distribución de la proteína LINE-1. Las células Huh7 se trataron sin (Ctrl) o con 0,5, 1 y 2 µg/mL de BNT162b2 durante 6 h. Las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpos que se unen a LINE-1 ORF1p (rojo) y con la sonda Hoechst específica de ADN para la visualización del núcleo celular (azul). (a) Imágenes representativas de la expresión de LINE-1 en las células Huh7 tratadas con o sin BNT162b2. (b-d) Cuantificación de la proteína LINE-1 en toda la zona celular (b), citosol (c) y núcleo (d). Todos los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía y los gráficos se crearon con GraphPad Prism V 9.2. Todos los datos se presentan como media ± SD (** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001 como se indica).

3.3. Detección del ADN de BNT162b2 transcrito inversamente en las células Huh7

Un estudio anterior ha demostrado que la entrada de la proteína LINE-1 en el núcleo está asociada a la retrotransposición [35]. En el experimento de tinción de inmunofluorescencia descrito anteriormente, se observó un aumento de los niveles de LINE-1 en el núcleo ya en la concentración más baja de BNT162b2 (0,5 µg/mL). Para examinar si BNT162b2 se transcribe de forma inversa en el ADN cuando LINE-1 se eleva, purificamos el ADN genómico de las células Huh7 tratadas con 0,5 µg/mL de BNT162b2 durante 6, 24 y 48 h. El ADN purificado se trató con RNasa para eliminar el ARN y se sometió a PCR utilizando cebadores dirigidos a BNT162b2, como se ilustra en la Figura 1. Los fragmentos de ADN amplificados se visualizaron por electroforesis y se purificaron en gel (Figura 5). Se detectaron amplicones de ADN de BNT162b2 en los tres puntos temporales (6, 24 y 48 h). La secuenciación de Sanger confirmó que los amplicones de ADN eran idénticos a la secuencia de BNT162b2 flanqueada por los cebadores (Tabla 2). Para asegurar que los amplicones de ADN se derivaban del ADN y no del ARN de BNT162b2, también realizamos la PCR en ARN purificado de células Huh7 tratadas con 0,5 µg/mL de BNT162b2 durante 6 h, con o sin tratamiento con RNasa (Ctrl 5 y 6 en la Figura 5), y no se detectó ningún amplicón en las muestras de ARN sometidas a PCR.

Figura 5. Detección de amplicones de ADN de BNT162b2 en células Huh7 tratadas con BNT162b2. Las células Huh7 fueron tratadas sin (Ctrl) o con 0,5 µg/mL de BNT162b2 durante 6, 24 y 48 h. El ADN genómico fue purificado y digerido con 100 µg/mL de RNasa. Se realizó la PCR en todas las muestras con cebadores dirigidos a BNT162b2, como se muestra en la Figura 1 y la Tabla 1. Los amplicones de ADN (444 bps) se visualizaron en un gel de agarosa. BNT: BNT162b2; L: escalera de ADN; Ctrl1: células Huh7 cultivadas; Ctrl2: Células Huh7 sin tratamiento con BNT162b2 recogidas a las 6 h; Ctrl3: células Huh7 sin tratamiento con BNT162b2 recogidas a las 24 h; Ctrl4: células Huh7 sin tratamiento con BNT162b2 recogidas a las 48 h; Ctrl5: ARN de células Huh7 tratadas con 0,5 µg/mL de BNT162b2 durante 6 h; Ctrl6: ARN de células Huh7 tratadas con 0,5 µg/mL de BNT162b2 durante 6 h, digerido con RNasa.

Tabla 2: Resultado de secuenciación Sanger del amplicon de BNT162b2

4. Discusión

En este estudio presentamos pruebas de que la vacuna COVID-19 mRNA BNT162b2 es capaz de entrar en la línea celular hepática humana Huh7 in vitro. El ARNm de BNT162b2 se transcribe de forma inversa intracelularmente en ADN tan rápido como 6 h después de la exposición a BNT162b2. Un posible mecanismo para la transcripción inversa es a través de la transcriptasa inversa endógena LINE-1, y la distribución de proteínas del núcleo de LINE-1 es elevada por el BNT162b2.

Se ha demostrado in vivo la acumulación intracelular de LNP en los hepatocitos [36]. Un estudio preclínico sobre el BNT162b2 mostró que el BNT162b2 entra en la línea celular humana HEK293T y conduce a una expresión robusta del antígeno BNT162b2 [37]. Por lo tanto, en este estudio, primero investigamos la entrada de BNT162b2 en la línea celular de hígado humano Huh7. La elección de las concentraciones de BNT162b2 utilizadas en este estudio merece una explicación. El BNT162b2 se administra en una serie de dos dosis con tres semanas de diferencia, y cada dosis contiene 30 µg de BNT162b2 en un volumen de 0,3 mL, lo que hace que la concentración local en el lugar de la inyección sea de 100 µg/mL [31]. Un estudio anterior sobre vacunas de ARNm contra los virus de la gripe H10N8 y H7N9 utilizando un sistema de administración similar de PNL mostró que la vacuna de ARNm puede distribuirse de forma bastante inespecífica a varios órganos como el hígado, el bazo, el corazón, el riñón, el pulmón y el cerebro, y la concentración en el hígado es aproximadamente 100 veces menor que la del lugar de inyección intramuscular [38]. En el informe de evaluación del BNT162b2 proporcionado a la EMA por Pfizer, los estudios de distribución farmacocinética en ratas demostraron que una proporción relativamente grande (hasta el 18%) de la dosis total se distribuye al hígado [26]. Por lo tanto, optamos por utilizar 0,5, 1 y 2 μg/mL de vacuna en nuestros experimentos con las células del hígado. Sin embargo, el efecto de una gama más amplia de concentraciones más bajas y más altas de BNT162b2 también debe ser verificado en futuros estudios.

En el presente estudio, empleamos una línea celular hepática humana para la investigación in vitro. Merece la pena investigar si las células hepáticas también presentan la proteína de pico derivada de la vacuna contra el SARS-CoV-2, lo que podría convertir a las células hepáticas en objetivos para las células T citotóxicas reactivas a la proteína de pico previamente preparadas. Ha habido informes de casos de individuos que desarrollaron hepatitis autoinmune [39] después de la vacunación con BNT162b2. Para obtener una mejor comprensión de los efectos potenciales del BNT162b2 en la función hepática, se desean modelos in vivo para futuros estudios.

En el informe sobre la toxicidad del BNT162b2, no se han proporcionado estudios de genotoxicidad ni de carcinogenicidad [26]. Nuestro estudio muestra que el BNT162b2 puede transcribirse de forma inversa al ADN en la línea celular hepática Huh7, y esto puede dar lugar a la preocupación de si el ADN derivado del BNT162b2 puede integrarse en el genoma del huésped y afectar a la integridad del ADN genómico, lo que puede mediar potencialmente efectos secundarios genotóxicos. En este momento, no sabemos si el ADN transcrito inversamente a partir del BNT162b2 se integra en el genoma celular. Se necesitan más estudios para demostrar el efecto del BNT162b2 en la integridad genómica, incluida la secuenciación del genoma completo de las células expuestas al BNT162b2, así como de los tejidos de los sujetos humanos que recibieron la vacuna BNT162b2.

El retrotransposón autónomo humano LINE-1 es una transcriptasa inversa endógena celular y el único transposón activo que queda en los humanos, capaz de retrotransponerse a sí mismo y a otros elementos no autónomos [40,41], y ~17% del genoma humano está compuesto por secuencias LINE-1 [42]. Los elementos Alu no autónomos, los elementos de nucleótidos cortos e intercalados (SINEs), las repeticiones en tándem de número variable (VNTR), así como los pseudogenes celulares procesados por el ARNm, son retrotranspuestos por las proteínas de retrotransposición LINE-1 que trabajan en trans [43,44]. Un estudio reciente demostró que la LINE-1 endógena media la transcripción inversa y la integración de las secuencias del SARS-CoV-2 en los genomas de las células humanas infectadas [25]. Además, la expresión de LINE-1 endógena suele aumentar en caso de infección vírica, incluida la del SARS-CoV-2 [45,46,47]. Estudios anteriores demostraron que la actividad de retrotransposición de LINE-1 está regulada por el metabolismo del ARN [48,49], la respuesta al daño del ADN [50] y la autofagia [51]. La retrotransposición eficiente de LINE-1 se asocia a menudo con el ciclo celular y la ruptura de la envoltura nuclear durante la mitosis [52,53], así como con retrovirus exógenos [54,55], lo que promueve la entrada de LINE-1 en el núcleo. En nuestro estudio, observamos un aumento de la distribución de LINE-1 ORF1p determinada por inmunohistoquímica en el núcleo por BNT162b2 en todas las concentraciones probadas (0,5, 1 y 2 μg/mL), mientras que se detectó una elevada expresión del gen LINE-1 en la concentración más alta de BNT162b2 (2 μg/mL). Cabe destacar que la transcripción de genes está regulada por modificaciones de la cromatina, la regulación de los factores de transcripción y la tasa de degradación del ARN, mientras que la regulación traslacional de las proteínas implica el reclutamiento del ribosoma en el codón de iniciación, la modulación de la elongación del péptido, la terminación de la síntesis de proteínas o la biogénesis del ribosoma. Estos dos procesos están controlados por mecanismos diferentes y, por lo tanto, es posible que no muestren siempre los mismos patrones de cambio en respuesta a los desafíos externos. La regulación exacta de la actividad de LINE-1 en respuesta a BNT162b2 merece un estudio más profundo.

El modelo celular que hemos utilizado en este estudio es una línea celular de carcinoma, con replicación activa del ADN, que difiere de las células somáticas no divididas. También se ha demostrado que las células Huh7 muestran una expresión génica y proteica significativamente diferente, incluyendo la regulación al alza de las proteínas implicadas en el metabolismo del ARN [56]. Sin embargo, la proliferación celular también es activa en varios tejidos humanos, como la médula ósea o las capas basales de los epitelios, así como durante la embriogénesis, por lo que es necesario examinar el efecto de BNT162b2 en la integridad genómica en tales condiciones. Además, también se ha informado de la retrotransposición efectiva de LINE-1 en células que no se dividen y en células terminalmente diferenciadas, como las neuronas humanas [57,58].

El informe de evaluación de la EMA de Pfizer también mostró que el BNT162b2 se distribuye en el bazo (<1,1%), las glándulas suprarrenales (<0,1%), así como una radiactividad baja y medible en los ovarios y los testículos (<0,1%) [26]. Además, en el informe de evaluación de la EMA de Pfizer no se dispone de datos sobre la transferencia placentaria del BNT162b2. Nuestros resultados mostraron que el ARNm del BNT162b2 entra fácilmente en las células Huh7 a una concentración (0,5 µg/mL) correspondiente al 0,5% de la concentración en el lugar de la inyección local, induce cambios en la expresión del gen y de la proteína LINE-1, y en 6 h se puede detectar la transcripción inversa del BNT162b2. Por lo tanto, es importante investigar más el efecto del BNT162b2 en otros tipos de células y tejidos tanto in vitro como in vivo.

5. Conclusiones

Nuestro estudio es el primer estudio in vitro sobre el efecto de la vacuna COVID-19 mRNA BNT162b2 en la línea celular del hígado humano. Presentamos pruebas sobre la rápida entrada de BNT162b2 en las células y la posterior transcripción inversa intracelular de ARNm de BNT162b2 en ADN.

Materiales complementarios

La siguiente información de apoyo se puede descargar en: https://www.mdpi.com/article/10.3390/cimb44030073/s1.

Contribuciones de los autores

M.A., F.O.F., D.Y., M.B. y C.L. realizaron los experimentos in vitro. M.A. y F.O.F. realizaron el análisis de los datos. M.R. y Y.D.M. contribuyeron a la realización de la investigación, diseñaron y supervisaron el estudio. Y.D.M. redactó el artículo con las aportaciones de todos los autores. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Financiación Este estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación, Área de Investigación Estratégica Exodiab, Dnr 2009-1039, el Fondo del Gobierno Sueco para la Investigación Clínica (ALF) y la fundación del Hospital Universitario de Skåne.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional No se aplica.

Declaración de consentimiento informado No se aplica.

Declaración de disponibilidad de datos Todos los datos que apoyan los resultados de este estudio están disponibles en el artículo y en la información de apoyo.

Agradecimientos Los autores agradecen a Sven Haidl, Maria Josephson, Enming Zhang, Jia-Yi Li, Caroline Haikal y Pradeep Bompada su apoyo a este estudio.

Conflictos de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.


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